近期，深圳細(xì)胞谷研發(fā)部部長趙麗君博士以第一作者、北京大學(xué)深圳研究生院曹宇教授為通訊作者，在國際知名期刊《Protein & Cell》（SCI一區(qū)期刊，影響因子13.6）上發(fā)表論文“A novel loop-structure-based bispecific CAR that targets CD19 and CD22 with enhanced therapeutic efficacy against B-cell malignances”。而這項(xiàng)工作正是細(xì)胞治療中基礎(chǔ)研究到工業(yè)轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用的優(yōu)秀案例。

嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞療法在治療B細(xì)胞惡性腫瘤領(lǐng)域已取得顯著成效，但部分患者仍面臨復(fù)發(fā)問題。為解決抗原逃逸及抗原表達(dá)的異質(zhì)性，研究者們設(shè)計了多種形式的識別雙重或多種抗原的CAR構(gòu)建體以降低復(fù)發(fā)率，然而近年來報道的幾乎所有CD19/CD22雙特異性CAR都存在CD22靶向不足的問題，這是由CD19抗體和CD22抗體的空間構(gòu)型引起的。

大多數(shù)報道的CD19/CD22 CAR-T細(xì)胞在CD19刺激下保持強(qiáng)烈的反應(yīng)，但在CD22介導(dǎo)的活性下表現(xiàn)出較低的效力。考慮到scFv聚集引起的潛在tonic信號，我們提出了一種新的CD19/CD22雙特異性結(jié)構(gòu)（CD19/CD22 LoopCAR-1），用CD22納米抗體取代CD22 scFv。與已經(jīng)上臨床的LoopCAR-4或其他環(huán)狀結(jié)構(gòu)CD19/CD22 CAR相比，CD19/CD22 LoopCAR-1表現(xiàn)出更好的CD22重定向活性，這表明LoopCAR-1可能提供了幾何上最優(yōu)的免疫突觸（IS)，并展現(xiàn)出有效的雙重特異性和突出的抗白血病活性。這種新穎的結(jié)構(gòu)設(shè)計為使用帶有納米抗體和scFv進(jìn)行環(huán)狀結(jié)構(gòu)設(shè)計提供了獨(dú)特的思路，并可能將CAR-T細(xì)胞治療的范圍擴(kuò)展到實(shí)體腫瘤，以及癌癥以外的適應(yīng)癥。

首先，研究人員分別采用了G4S Linker、Long Hinge Lama Linker和β-Stranded Loop Linker構(gòu)建了三種不同形式的CD19/CD22 CAR，分別命名為TanCAR-1、TanCAR-2和LoopCAR-1。經(jīng)驗(yàn)證，LoopCAR-1不僅顯著增強(qiáng)CAR-T對B-ALL患者細(xì)胞的殺傷活性，也顯著提高了細(xì)胞因子釋放水平并促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能是雙特異性CD19/CD22 CAR的最佳設(shè)計。

基于此環(huán)狀結(jié)構(gòu)，研究人員通過替換Linker和CD22納米抗體，進(jìn)一步設(shè)計了CD19/CD22環(huán)狀CAR結(jié)構(gòu)。

在四種結(jié)構(gòu)中，LoopCAR-1和LoopCAR-2對Nalm6和Nalm6 KO19細(xì)胞的影響尤為顯著。經(jīng)過兩輪靶細(xì)胞刺激后，所有結(jié)構(gòu)的CAR-T都表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，而LoopCAR-1比其他雙特異性CARs具有更持久的細(xì)胞殺傷活性。此外，我們觀察到LoopCAR-1再刺激后效應(yīng)T細(xì)胞群增加，但耗盡標(biāo)志物的表達(dá)減少，這表明LoopCAR-1對CD19抗原丟失的靶細(xì)胞具有持續(xù)的抗腫瘤活性。以上結(jié)果顯示了抗體和Linker的選擇在CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計中的關(guān)鍵作用，LoopCAR-1是最佳的CD19/CD22雙特異性CAR結(jié)構(gòu)。

為了評估其體內(nèi)的抗腫瘤效果，研究人員使用Nalm6細(xì)胞（CD19+CD22+）構(gòu)建異種移植小鼠白血病模型測試各CAR-T細(xì)胞的療效。結(jié)果顯示，接受LoopCAR-1處理的小鼠體重未下降，且存活時間顯著延長。此外，這些小鼠的血清細(xì)胞因子水平高于接受CD19 CAR、CD22 CAR或單靶點(diǎn)CAR-T聯(lián)合治療組。這些結(jié)果表明，LoopCAR-1在體內(nèi)對CD19+CD22+腫瘤具有強(qiáng)效殺傷作用。

而后，研究人員進(jìn)一步評估了LoopCAR-1在CD19或CD22敲除的免疫逃逸模型（1:1比例）和擬臨床復(fù)發(fā)模型（1:1:1比例）中的表現(xiàn)，結(jié)果顯示LoopCAR-1能顯著抑制腫瘤生長，延緩疾病進(jìn)展，延長生存期，提高血清細(xì)胞因子水平，且未引起體重下降。然而，與LoopCAR-1相比，LoopCAR-4和單靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療組在減少腫瘤負(fù)荷方面表現(xiàn)不佳。這強(qiáng)調(diào)了LoopCAR-1結(jié)構(gòu)的優(yōu)越性。綜上所述，針對白血病，LoopCAR-1結(jié)構(gòu)的雙靶點(diǎn)CAR-T發(fā)揮了最佳療效，防止了免疫逃逸和與單特異性治療相關(guān)的腫瘤復(fù)發(fā)。

最后，研究人員評估了CAR-T細(xì)胞治療對臨床相關(guān)的B-ALL PDX模型的療效。結(jié)果展示，盡管使用環(huán)狀CAR或單靶點(diǎn)CAR聯(lián)合治療的小鼠均無法完全根除原代B-ALL細(xì)胞，但與其他CAR-T細(xì)胞療法相比，LoopCAR-1治療組在后期仍具有較強(qiáng)的抗白血病活性、更高的總存活率和更多的Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，復(fù)發(fā)后白血病細(xì)胞保持了CD19和CD22的表達(dá)，排除了CAR應(yīng)激介導(dǎo)的抗原丟失。這些結(jié)果表明，LoopCAR-1對B-ALL PDX模型具有穩(wěn)定的治療效果，揭示其是一種很有前途的臨床治療候選藥物。

綜上所述，本研究開發(fā)了一種新型雙特異性CD19/CD22 LoopCAR-T，相較于其他環(huán)狀CD19/CD22 CAR，該結(jié)構(gòu)在增強(qiáng)CD22重定向信號傳導(dǎo)方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。通過與已進(jìn)入臨床的CAR-T細(xì)胞或單靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療組的對比，強(qiáng)調(diào)了雙特異性CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)設(shè)計和優(yōu)化的重要性。對于表達(dá)CD19及或CD22的B-ALL或淋巴瘤患者，LoopCAR-1展現(xiàn)出了更持久的臨床治療價值。目前該新型雙特異性CD19/CD22 LoopCAR-T已由深圳細(xì)胞谷制備并應(yīng)用于臨床，已在華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院（南山醫(yī)院）進(jìn)行4例B細(xì)胞惡性腫瘤患者的臨床治療，效果顯著。感興趣的廣大讀者們歡迎聯(lián)系我司進(jìn)行深入交流！

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