腫瘤細胞免疫療法--CAR-NK和CAR-M細胞療法
免疫系統(tǒng)中的T細胞可以靶向殺傷腫瘤細胞，而T細胞殺傷腫瘤細胞依賴于對腫瘤抗原的特異性識別。但T細胞受體（T cell receptor，TCR）識別腫瘤抗原的模式受到人類白細胞抗原（human Leukocyte antigen，HLA）分子的限制，且面對腫瘤細胞HLA分子表達的下調(diào)以及免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，TCR很難激活T細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。為了突破HLA分子的限制，一種工程化改造的分子——嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）誕生了。CAR的結構類似于TCR，由胞外特異性腫瘤抗原識別區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜結構域、共刺激域以及胞內(nèi)信號傳導域五部分組成。胞外特異性腫瘤抗原識別區(qū)可由抗體單鏈可變區(qū)（針對腫瘤抗原特異性抗體的重鏈和輕鏈）或納米抗體組成，能夠以非HLA分子限制的模式直接識別腫瘤相關抗原或者特異性抗原，并通過胞內(nèi)信號域傳導信號、活化效應T細胞實現(xiàn)特異性殺傷腫瘤的效果[1]。
將這種針對腫瘤特異性抗原或者腫瘤相關抗原的CAR通過基因工程的方法表達于T細胞表面，并經(jīng)體外擴增后過繼輸注給相應腫瘤患者的療法稱之為CAR-T細胞免疫療法，而表達了CAR分子的T細胞被稱為CAR-T細胞（圖1）[2]。除T細胞外，CAR也能表達于其他免疫細胞表面，如自然殺傷細胞（Natural Killer cells，NK）、巨噬細胞（Macrophage）、γδT細胞、DC細胞等免疫細胞，這對應的就是CAR-NK細胞、CAR-M細胞、CAR-γδT細胞、CAR-DC細胞。
近些年，CAR-T療法在惡性腫瘤的治療上取得了顯著成就，尤其是在血液瘤的治療上表現(xiàn)出了極佳的治療效果，被認為是最有希望治愈腫瘤的治療方法之一。目前利用CAR-T技術治療的血液系統(tǒng)腫瘤包括急性髓系白血病、急性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等，并且在治療肝癌、前列腺癌等實體瘤中也具有一定的效果。截止2023年9月，全球共上市了9款CAR-T治療藥物，靶點為CD19和BCMA，主要用于治療血液腫瘤。其中，據(jù)吉利德2023年前三季度財報統(tǒng)計，Yescarta（Anti-CD19 CAR-T）和Tecartus（Anti-CD19 CAR-T）兩款細胞產(chǎn)品銷售額達到14.02億美金（合計約102億人民幣），其市場潛力可見一斑。
但其目前也存在一些挑戰(zhàn)與不足。其一是臨床治療安全性問題，CAR-T療法在臨床容易出現(xiàn)細胞毒副作用，最常見的CAR-T細胞的毒副作用為細胞因子釋放綜合征（CRS）和免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）［3］。嚴重的CRS和ICANS 有致命風險，因此如何提高CAR-T療法的安全性，降低細胞毒副作用，成為了細胞藥物研發(fā)亟需解決的問題。其二是由于多方面的原因[4]（詳見前期推文），CAR-T療法在實體腫瘤的治療上效果不甚理想。第三則是由于目前CAR-T療法為個體化定制治療，產(chǎn)能受限，費用高昂，大多數(shù)國內(nèi)患者無法支付。
基于自體CAR-T療法在實體瘤中所面臨的的種種問題，人們迫切期待一種可以通用的、現(xiàn)貨型的、可以大規(guī)模制備的細胞治療產(chǎn)品出現(xiàn)，而CAR-NK療法，或將為實現(xiàn)這一目標帶來希望。
三、CAR-NK療法
自然殺傷細胞（NK細胞）來源于骨髓淋巴樣干細胞，占成人外周血淋巴細胞的5%~15%，是重要的固有免疫細胞，因其非專一性的細胞毒作用而被命名。NK細胞在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮關鍵作用，其通過直接溶解和分泌細胞因子等作用殺傷腫瘤細胞，因此開發(fā)它的抗癌功能是近年來癌癥研究的熱點。
不同于T細胞通過TCR特異性識別MHC-抗原肽復合物產(chǎn)生活化信號進而激活的方式，NK細胞發(fā)揮殺傷靶細胞的作用無須抗原刺激、也無需抗原提呈，且不受自體MHC限制性。NK細胞表面表達復雜的受體譜，主要包括殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)、C型凝集素樣受體家族和NKp30、NKp44、NKp46等激活性自然細胞毒受體(NCR)。按其功能可分為抑制性和活化性受體，與相應配體作用分別傳導抑制性和活化性信號，NK細胞的激活由2種信號間的平衡決定[5]。被激活的NK細胞通過多種機制“消滅”靶細胞細胞(如圖3)，例如：①釋放穿孔素和顆粒酶，使靶細胞裂解或凋亡；②促進腫瘤細胞FasL表達，誘導腫瘤細胞凋亡；③釋放 TNF-α、IFN-γ、GM-CSF 和趨化因子(例如 CCL1、CCL2、CCL3等)，募集和激活其他效應免疫細胞等。
和CAR-T療法相比，CAR-NK 療法具有以下幾個優(yōu)勢：
1）CAR-NK 細胞來源廣泛（圖4），可從包括 NK92 細胞系、PBMC 和 iPSC 在內(nèi)的多種臨床樣本或商業(yè)化細胞系獲取，且 CAR-NK 細胞可以作為“現(xiàn)貨型”細胞治療產(chǎn)品[6]；
2）CAR-NK 細胞在循環(huán)中的壽命有限，因此對正常組織的靶向/脫瘤毒性風險相對較低；
3）使用CAR-NK細胞治療后CRS風險低：不同于CAR-T細胞在體內(nèi)持續(xù)擴增并產(chǎn)生如IL6、IL1β等促炎因子，NK細胞主要分泌IFN-γ和GM-CSF，且在體內(nèi)數(shù)周內(nèi)不會擴增，從而降低了CRS發(fā)生的風險；
4）CAR-NK細胞不需要進行嚴格的HLA基因匹配：異體來源NK細胞不表達個體特異性TCR，引起移植物抗宿主?。℅VHD）的潛在風險遠低于CAR-T細胞治療；
5）NK細胞殺傷腫瘤細胞的途徑多，經(jīng)過CAR修飾的NK細胞既能夠通過 CAR依賴性的方式清除抗原特異性腫瘤，又能通過NK細胞受體依賴性機制有效根除某些不表達CAR靶向抗原的異質(zhì)性腫瘤。
表1 CAR-T與CAR-NK的對比（表格來源：西南證券）
四、CAR-M療法
巨噬細胞（M）具有高度異質(zhì)性，可塑能力強，有吞噬作用、抗原呈遞和浸潤能力。巨噬細胞對抗癌癥的嘗試始于幾十年前，然而早期臨床試驗的療效評估表明巨噬細胞移植療法效果甚微，巨噬細胞需要額外的信號來指導其對抗腫瘤。因此，以CAR-T/NK的發(fā)展?jié)摿椭苽溥^程作為參照模板，研究人員開始研究將單核/巨噬細胞作為細胞免疫治療的載體細胞，結合目前蓬勃發(fā)展的嵌合抗原受體技術與日漸成熟的基因工程優(yōu)化技術，從分子水平上改造單核/巨噬細胞，制備獲嵌合抗原受體-巨噬細胞(CAR-M) ，利用其高效浸潤性，增強其吞噬能力及抗原遞呈能力，以應用于腫瘤領域。CAR-M有望成為細胞免疫治療的新一代主角。
圖5 巨噬細胞殺傷腫瘤示意圖
與CAR-T不同，CAR-M主要有三大優(yōu)勢：
1) 首先巨噬細胞可以輕松侵入腫瘤微環(huán)境（TME）中吞噬腫瘤細胞，影響TME中腫瘤相關巨噬細胞（TAM）的比例，改變TAM的表型(由M2轉變?yōu)镸1)；
2) 其次，巨噬細胞還可上調(diào)抗原呈遞機制相關分子的表達，如組織相容性復合物 II 類 （MHC-II）、CD80和CD86，可作為抗原呈遞細胞，通過交叉呈遞吞噬抗原來激活適應性免疫應答；
3) 最后CAR-M的循環(huán)有時限，非腫瘤靶向毒性較小。
CAR-M的首次報道是在2020年，目前絕大多數(shù)研究仍處于科研階段，產(chǎn)業(yè)化還在初期階段。雖然從理論而言，CAR-M療法對實體瘤具有明顯優(yōu)勢，但還處于“嬰兒期”，要想真正加入臨床應用，仍需克服許多困難，如：
1）來源與擴增問題。與CAR-T/NK不同，T細胞和NK細胞可從患者體中提取而來然后可在實驗室中大量擴增，但巨噬細胞在體外幾乎不擴增，大量獲取是一大難題。而永生化或腫瘤細胞系并不能良好的代表原代細胞的性質(zhì)，對于CAR-M的研究提供的作用有限。
2）巨噬細胞天然對常用的病毒載體具有抗性。巨噬細胞是人體抗擊癌細胞和病毒的第一道防線，因此可能會對常用的標準病毒載體產(chǎn)生抗性，導致病毒載體無法高效感染巨噬細胞制備CAR-M，這是限制CAR-M療法開發(fā)的重大挑戰(zhàn)之一。且轉導后的CAR-M需要進行陽性分選才能更好的進行下游抗腫瘤功能驗證。
目前深圳細胞谷對于CAR-NK和CAR-M的制備方面均有重大突破，隨時歡迎各位CGT領域前輩一起交流學習和蒞臨指導工作。
參考文獻
[1] 趙嫄，胡婉麗，張連生.嵌合抗原受體療法在血液腫瘤免疫治療中的研究進展與應用前景［J/CD］.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2014，8（6）：1158-1161.
[2]Chen YJ, Abila B, Mostafa Kamel Y. CAR-T: What Is Next? Cancers (Basel). 2023 Jan 21;15(3):663.
[3]李賀,任嘉慧,石穎慧等.CAR-T細胞療法傳統(tǒng)領域的前沿進展[J].中國醫(yī)藥導刊,2022,24(10):966-973.
[4]黨可純,王金偉.CAR-T細胞治療實體瘤的挑戰(zhàn)與應對策略[J].藥學與臨床研究,2022,30(06):529-535.
[5]劉洪秀，韓艷秋．CAR-NK細胞治療血液腫瘤的研究進展[J]．臨床血液學雜志，2023，36(1)：76-80.
[6]Lu H, Zhao X, Li Z, Hu Y, Wang H. From CAR-T Cells to CAR-NK Cells: A Developing Immunotherapy Method for Hematological Malignancies. Front Oncol. 2021 Aug 6;11:720501.
