2023年9月29日，Carl June教授團(tuán)隊在Immunity期刊發(fā)表了題為：Deletion of the inhibitory co-receptor CTLA-4 enhances and invigorates chimeric antigen receptor T cells  的研究論文。他們這項研究表明，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的CTLA-4缺失改善了CAR-T細(xì)胞增殖和抗腫瘤療效。
在機(jī)制上，CTLA-4缺失允許CD28的信號傳導(dǎo)，并可維持T細(xì)胞表面的 CAR 表達(dá)。在臨床研究中，CTLA-4的缺失挽救了以前CAR-T治療失敗的白血病患者的T細(xì)胞功能。因此，CTLA-4的選擇性缺失使功能失調(diào)的慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者的T細(xì)胞重新活躍，為增加患者對CAR-T細(xì)胞治療的反應(yīng)提供了一種新的策略。 為了評估CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PD-1和CTLA-4檢查點受體缺失是否可以提高靶向CD19的嵌合抗原受體T細(xì)胞（CART19）的療效，他們制備了人源化的CART19細(xì)胞進(jìn)行實驗。在確保有效敲除的基礎(chǔ)上，他們發(fā)現(xiàn)PD-1和/或CTLA-4缺失的CART19細(xì)胞表現(xiàn)出類似的增殖能力、記憶表型、抑制受體水平和表面CAR表達(dá)。同樣地，WT和編輯過的CART19細(xì)胞顯示出同等水平的細(xì)胞毒活性、脫顆粒能力等。 為了確定是否缺失PD-1和/或CTLA-4可以預(yù)防或延遲CAR-T功能障礙，他們開發(fā)了一種使用慢性抗原暴露（CAE）的體外應(yīng)激試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PD-1缺陷的CART19細(xì)胞和PD-1/CTLA-4均缺陷的CART19細(xì)胞相比，CTLA-4 缺陷的CART19細(xì)胞表現(xiàn)出雙倍擴(kuò)增能力和抗腫瘤功效增強。
在進(jìn)一步的應(yīng)激測試中，與WT、PD-1缺陷的CART19細(xì)胞和 PD-1/CTLA-4均缺陷的CART19細(xì)胞相比，CTLA-4缺陷的CART19細(xì)胞分泌的GM-CSF、IL-13和CCL5水平增加。在CAE刺激條件下，CTLA-4缺陷的CART19細(xì)胞都比WT細(xì)胞表現(xiàn)出更高的擴(kuò)增能力和腫瘤清除能力。 CAR-T細(xì)胞如果失去表面CAR表達(dá)，則會導(dǎo)致CAR靶向功能障礙。CTLA-4缺失的CART19細(xì)胞在CAR功能障礙模型中顯示出更高的抗腫瘤功效，這促使他們檢測了WT和CART19編輯組中表面CAR表達(dá)的相對水平。與WT、PD-1缺失的CART19細(xì)胞以及PD-1/CTLA-4均缺失的CART19細(xì)胞相比，CTLA-4缺失的CART19細(xì)胞在應(yīng)激檢測中維持了表面CAR表達(dá)。同樣地，在反復(fù)刺激后，NR和PR CLL患者的WT CART19細(xì)胞均表現(xiàn)出表面CAR表達(dá)百分比的降低，而CTLA-4缺失的CAR-T細(xì)胞則維持了表面CAR表達(dá)，并顯示出顯著改善的細(xì)胞殺傷活性，從而減少腫瘤負(fù)擔(dān)。他們也借助小鼠模型驗證了上述發(fā)現(xiàn)。

為了研究驅(qū)動CTLA-4缺失CAR-T細(xì)胞提高抗腫瘤療效的分子途徑，他們對CAE刺激后第0天和第15天的WT和CTLA-4缺失CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序 （scRNA-seq）。為了深入了解CTLA-4的缺失如何影響T細(xì)胞的廣泛分布，他們繪制了每個亞群中的相對細(xì)胞數(shù)量。有趣的是，在第15天，與WT CART19細(xì)胞相比，CTLA-4缺失的CART19細(xì)胞在增殖亞群中的細(xì)胞比例更高，而在終末效應(yīng)亞群、應(yīng)激亞群和凋亡亞群中的細(xì)胞比例更低。這些數(shù)據(jù)提供了關(guān)于CTLA-4缺失CAR-T細(xì)胞如何優(yōu)于WT CAR-T細(xì)胞的見解。為了從體外應(yīng)激功能障礙模型中識別功能障礙基因，他們在CAE刺激后第0天和第15天測定了差異表達(dá)基因。他們觀察到了衰竭基因的上調(diào)，如CTLA-4、HAVCR2、LAG-3、KLRD1、IL-2RA、ENTPD1、GNLY、LAYN、CCL3、CCL4、TNFRSF18 和DUSP4。

為了從機(jī)制上理解CTLA-4缺失如何促進(jìn)白血病患者CAR-T細(xì)胞在應(yīng)激測試后抗腫瘤療效的提高，他們鑒定并比較了來自ND和CLL CAR-T細(xì)胞的WT和CTLA-4缺失細(xì)胞的DEGs。在CTLA-4缺失的ND和CLL CAR-T 細(xì)胞中有許多常見的上調(diào)通路，糖酵解是唯一被下調(diào)的通路。在應(yīng)激測試后的ND和CLL CTLA-4缺失CAR-T細(xì)胞中，參與細(xì)胞周期調(diào)控的通路也出現(xiàn)在上調(diào)的通路中。這表明，在CAR-T細(xì)胞中缺失免疫檢查點CTLA-4促進(jìn)了T細(xì)胞的擴(kuò)增。
他們進(jìn)一步在WT和CTLA-4缺陷的ND和CLL CAR-T細(xì)胞中檢測了CD28下游靶點的表達(dá)。CTLA-4缺失CAR-T細(xì)胞顯示GZMB、IL-2RA和 CDK6的上調(diào)，這些基因有助于更好的增殖和發(fā)揮效應(yīng)功能。此外，與WT CART19細(xì)胞相比，CTLA-4缺失CAR-T細(xì)胞的CD28共刺激水平增強。這也在異種移植小鼠模型中得到了重現(xiàn)，即與WT CLL CAR-T細(xì)胞相比，CTLA-4缺陷小鼠的外周血CAR-T細(xì)胞中檢測到細(xì)胞表面CD28的表達(dá)增加。基于這些數(shù)據(jù)，他們提出，CTLA-4在CAR-T細(xì)胞中的缺失導(dǎo)致了CD28信號的增強，從而維持了CAR-T細(xì)胞的共刺激和減少了CAR-T細(xì)胞功能障礙，這共同提高了CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)功能，增加了其增殖，并維持了細(xì)胞表面CAR的表達(dá)。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)并證明了CTLA-4缺失的CART19細(xì)胞在應(yīng)激測試條件下具有優(yōu)越的抗腫瘤功效，更加重要的是，他們證實了這些結(jié)果的臨床相關(guān)性，即 CTLA-4的缺失可以增強人類T細(xì)胞的適應(yīng)性，并能夠從失敗的CLL患者T細(xì)胞中制造出有效的CART19細(xì)胞產(chǎn)品?？傊?，CTLA-4的缺失可以激活患者的T細(xì)胞，為增加CAR-T細(xì)胞治療的持久反應(yīng)提供了一種新的策略。

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