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細(xì)胞治療中安全性開(kāi)關(guān)的應(yīng)用
患者在完成自體或異體細(xì)胞輸注后，大量免疫細(xì)胞被激活并快速增殖，引起IL-6、IL-1、IL-12、TNF-α、IFN-α、GM-CSF等細(xì)胞因子的過(guò)度級(jí)聯(lián)釋放，導(dǎo)致發(fā)生發(fā)熱、低血壓、毛細(xì)血管滲漏、缺氧和終末器官功能障礙等癥狀，也被稱為細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome, CRS)。為了應(yīng)對(duì)患者在接受細(xì)胞治療后出現(xiàn)CRS，目前有兩種方法，一方面可以通過(guò)CRS和神經(jīng)毒性的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)密集的監(jiān)測(cè)及時(shí)做出反應(yīng)；另一方面是設(shè)計(jì)更加安全的細(xì)胞療法，而目前已經(jīng)達(dá)成共識(shí)的策略是給細(xì)胞裝上“安全開(kāi)關(guān)”，在人為可控下進(jìn)行治療，且在不良反應(yīng)發(fā)生前及時(shí)踩剎車，將有助于減輕毒副作用。
隨著技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)提供或去除小分子，提供基于蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，或通過(guò)物理刺激，如光、超聲波或熱，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行可逆性控制已變得可行[1]。
二、安全性開(kāi)關(guān)的類型
(一) 利用CID技術(shù)平臺(tái)
CID是化學(xué)誘導(dǎo)二聚化（Chemical Induced Dimerization），所謂的CID技術(shù)平臺(tái)（化學(xué)誘導(dǎo)的二聚體化技術(shù)）就是將特定DNA的分子導(dǎo)入靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞表達(dá)CID蛋白(如FKBP12)和目的蛋白，再通過(guò)加入小分子化合物CID誘導(dǎo)使之發(fā)生二聚化，從而讓相應(yīng)的CID蛋白發(fā)揮自身的功能。CID蛋白包括信號(hào)區(qū)域和結(jié)合區(qū)域，加入二聚誘導(dǎo)劑（如rimiducid）可以使之與CID結(jié)合區(qū)域結(jié)合成二聚物，二聚物就會(huì)開(kāi)啟下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
Caspase-9是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)酶，激活后會(huì)產(chǎn)生信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在過(guò)繼性細(xì)胞治療中可以通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)iCasp9以此控制細(xì)胞的生命活動(dòng)。iCasp9由CID蛋白序列通過(guò)linker與caspase9序列所組成（圖1 B），細(xì)胞當(dāng)暴露于二聚化誘導(dǎo)藥物時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致表達(dá)該結(jié)構(gòu)的細(xì)胞快速死亡，減輕治療中的嚴(yán)重副作用。
有研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了一種分子開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞的活性，只需要給予一種常用的抗癌藥物——來(lái)那度胺（lenalidomide）即可實(shí)現(xiàn)[3]。他們利用了一項(xiàng)被稱為靶向蛋白降解的新穎技術(shù)，包括來(lái)那度胺在內(nèi)的少數(shù)藥物可以通過(guò)該途徑靶向降解特定蛋白發(fā)揮作用。利用這一機(jī)制改造了小蛋白標(biāo)簽，當(dāng)這種降解標(biāo)簽被貼在CAR上后，在施用來(lái)那度胺期間，來(lái)那度胺會(huì)結(jié)合到CAR結(jié)構(gòu)的蛋白標(biāo)簽上去，就會(huì)誘導(dǎo)CRL4CRBN介導(dǎo)的泛素化和蛋白酶體降解，被標(biāo)記的CAR就會(huì)被降解，從而阻止T細(xì)胞識(shí)別癌細(xì)胞。由于T細(xì)胞還會(huì)不斷制造CAR蛋白，在撤除來(lái)那度胺后，新生成的CAR蛋白逐漸累積，CAR-T細(xì)胞恢復(fù)抗腫瘤功能。
圖2. 利用來(lái)那度胺調(diào)控CAR結(jié)構(gòu)的降解[3]
簡(jiǎn)單地說(shuō)，四環(huán)素(Tet)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)就是通過(guò)誘導(dǎo)藥物如Tet改變調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而控制目的蛋白的表達(dá)。在細(xì)菌系統(tǒng)中，正常情況下，四環(huán)素阻遏蛋白（tetR）將與四環(huán)素抗性操縱子（tetO）結(jié)合，抑制下游抗性基因tetA的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)存在四環(huán)素或者四環(huán)素類似物如強(qiáng)力霉素（Dox）時(shí)，tetR將與四環(huán)素結(jié)合，不再和tetO結(jié)合，造成下游抗性基因tetA表達(dá)，四環(huán)素就會(huì)通過(guò)tetA蛋白運(yùn)出到細(xì)胞外，細(xì)菌從而獲得耐藥性[4]。
圖3. 大腸桿菌的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)[4]
按照特點(diǎn)可以分為：激活性系統(tǒng)Tet-on和抑制型系統(tǒng)Tet-off。
Tet-off原理：tTA是由TetR和病毒轉(zhuǎn)錄激活域VP16融合而成的蛋白。當(dāng)不存在Dox時(shí)， tTA和TRE（7個(gè)重復(fù)的TetO序列）結(jié)合，啟動(dòng)下游基因表達(dá)；當(dāng)存在Dox時(shí)，tTA的構(gòu)象發(fā)生改變，tTA會(huì)TRE上脫落，從而導(dǎo)致下游基因表達(dá)關(guān)閉。
Tet-on原理：rtTA是由rTetR和VP16融合而成的蛋白，它的表型與tTA相反 。rtTA是一種反Tet阻遏物(rTetR)，并依賴四環(huán)素的存在進(jìn)行誘導(dǎo)，而不是抑制。當(dāng)Dox不存在時(shí)，rtTA不能結(jié)合TRE, 下游基因表達(dá)關(guān)閉。當(dāng)存在Dox時(shí)，rtTA的構(gòu)象發(fā)生改變，rtTA集合TRE，下游基因表達(dá)開(kāi)啟。
可以利用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)做到對(duì)目的基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，以此來(lái)控制細(xì)胞是否表達(dá)CAR結(jié)構(gòu)或者調(diào)控細(xì)胞的死亡。
參考文獻(xiàn)
[1]Sahillioglu, A.C. and T.N. Schumacher, Safety switches for adoptive cell therapy. Curr Opin Immunol, 2022. 74: p. 190-198.
[2]Di Stasi, A., et al., Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med, 2011. 365(18): p. 1673-83.
[3]Jan, M., et al., Reversible ON- and OFF-switch chimeric antigen receptors controlled by lenalidomide. Sci Transl Med, 2021. 13(575).
[4]https://2013.igem.org/Team:Bielefeld-Germany/Biosafety/Biosafety System M.
