近年來，CAR-T療法的成功讓人們看到免疫治療的巨大潛力，也成為人類攻克癌癥歷史上的重要里程碑。但目前CAR-T療法主要僅針對(duì)血液腫瘤且容易引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，這也促使科研人員開發(fā)更有效的細(xì)胞療法，CAR-NK的問世就被視為免疫治療的新一代利器。

所謂CAR-NK細(xì)胞治療，是通過基因工程技術(shù)將CAR表達(dá)于NK細(xì)胞表面，賦予和增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的靶向殺傷功能。NK細(xì)胞屬于固有淋巴細(xì)胞家族，存在于人外周血、骨髓和組織器官中，可以通過T細(xì)胞受體（TCR）和相關(guān)CD3分子的缺失，以及神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（也稱為CD56）的表達(dá)所鑒定。值得慶幸地是，異體來源NK細(xì)胞不表達(dá)個(gè)體特異性TCR，不同于T細(xì)胞通過TCR特異性識(shí)別MHC—抗原肽復(fù)合物產(chǎn)生活化信號(hào)進(jìn)而激活的方式，NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的作用無須抗原刺激、抗原提呈且無自體MHC限制性，在臨床治療中出現(xiàn)移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)低于異體T細(xì)胞治療。另外，基于NK細(xì)胞的“自我缺失”識(shí)別模式，無論是單獨(dú)輸注還是聯(lián)合造血干細(xì)胞移植，與受者KIR基因不相合的供者NK細(xì)胞抗腫瘤作用更強(qiáng)，更適宜被開發(fā)為通用型免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品，有利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

隨著基因修飾技術(shù)的進(jìn)步，許多方法被用于生產(chǎn)CAR-NK。CAR-NK細(xì)胞療法的主要挑戰(zhàn)之一是基因轉(zhuǎn)移效率低。與其他基因轉(zhuǎn)移方法相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)用途廣泛，高效且無明顯毒性。具體優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
一、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有相對(duì)中性的整合譜，遺傳毒性較小

臨床應(yīng)用最常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括源自人類免疫缺陷病毒-1（慢病毒載體）和莫洛尼鼠白血病病毒（γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）的載體。整合組分析表明，γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)先整合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CpG島和對(duì)癌癥有影響的基因附近，而慢病毒載體傾向于整合在主動(dòng)轉(zhuǎn)錄的基因中^[1]。相比之下，α逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有相對(duì)中性的整合譜，更有利于應(yīng)用到臨床研究中^[2]。然而，以前的研究使用攜帶病毒編碼序列和完整長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）的α逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。雖然病毒編碼序列在宿主細(xì)胞中具有潛在的免疫原性并增加載體動(dòng)員的風(fēng)險(xiǎn)，但含有轉(zhuǎn)錄元件的完整LTR能夠激活細(xì)胞基因并有助于插入誘變^[1]。

目前，已開發(fā)了γ和α逆轉(zhuǎn)錄病毒自失活（SIN）載體，從LTR中去除了增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件，并建立了一個(gè)先進(jìn)的分裂包裝系統(tǒng)，另外從載體中去除病毒編碼序列和逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接位點(diǎn)，以解決插入式誘變的問題^[6]。此外，通過多種策略，包括刪除自我復(fù)制所需的基因以及減少病毒基因組和載體生成細(xì)胞的重疊序列，已經(jīng)降低了形成復(fù)制能力逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）的可能性，這些策略已用于許多臨床研究^[3、4]。
二、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細(xì)胞效率高

幾十年來，逆轉(zhuǎn)錄病毒一直被用作基因治療載體。NK細(xì)胞對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的抵抗力的可能解釋可能源于細(xì)胞對(duì)病毒感染的固有防御機(jī)制。提高逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的策略包括用細(xì)胞因子（IL-2）和K562細(xì)胞預(yù)活NK細(xì)胞，以表達(dá)膜結(jié)合的IL-21。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞效率為27％-52％，編碼分泌型IL-15或膜結(jié)合型IL-15（mIL-15）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達(dá)70％^[3]。

不同種類的逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來制備CAR-NK細(xì)胞。與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉(zhuǎn)錄病毒在原代NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率上更高。在不同逆轉(zhuǎn)錄病毒中，α-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顯示出比γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更優(yōu)越的性能，在NK細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為90%，在受刺激的原代NK細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大于60%。

截止到2021年底，已經(jīng)有20項(xiàng)使用CAR-NK細(xì)胞系的研究和15項(xiàng)使用原代NK細(xì)胞的研究應(yīng)用了逆轉(zhuǎn)錄病毒。另外，最近的一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)中，由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD19 CAR-NK細(xì)胞治療CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。在這項(xiàng)研究中，73%的患者有響應(yīng)，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR-NK輸注后30天內(nèi)反應(yīng)迅速。經(jīng)過一年的隨訪，仍然可以檢測(cè)到擴(kuò)增的CAR-NK細(xì)胞。輸注后，外周血中的CAR-NK DNA拷貝數(shù)保持穩(wěn)定達(dá)一年之久，這些結(jié)果首次表明逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存活^[5]。
三、逆轉(zhuǎn)錄病毒可以通過穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系達(dá)到一致、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模的載體生產(chǎn)

隨著越來越多的臨床試驗(yàn)使用γ逆轉(zhuǎn)錄和慢病毒載體進(jìn)行穩(wěn)定基因組修飾的基因治療，對(duì)臨床適用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體批次的需求不斷增加，這表明經(jīng)濟(jì)載體生產(chǎn)對(duì)未來基因治療試驗(yàn)的重要性。與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，使用穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系有望實(shí)現(xiàn)一致、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模的載體生產(chǎn)，從而有可能治療更多的患者。

逆轉(zhuǎn)錄病毒獨(dú)特的復(fù)制能力允許轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地整合到目標(biāo)基因組并長(zhǎng)期表達(dá)CAR，但只能在分裂的NK細(xì)胞中表達(dá)。一般來說，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系產(chǎn)生。這兩種方法在建立、靈活性、可重復(fù)性、擴(kuò)大可能性和質(zhì)量保證方面具有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)。對(duì)于瞬時(shí)生產(chǎn)，將包裝系統(tǒng)的所有組件以質(zhì)粒的形式瞬時(shí)遞送到包裝細(xì)胞中。這允許靈活地改變載體成分。相比之下，建立穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系需要將所有組件穩(wěn)定地整合到產(chǎn)生病毒的包裝細(xì)胞系的基因組中，雖然前期工作需要較為耗時(shí)，且需要進(jìn)行技術(shù)平臺(tái)的搭建及活化。但是通過穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系生成病毒載體可以高水平在保證批次間產(chǎn)品一致性，而瞬時(shí)產(chǎn)生的病毒顆粒則受到顯著波動(dòng)的影響。由于要達(dá)到生產(chǎn)規(guī)范（GMP）級(jí)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)過程的升級(jí)成本高昂且技術(shù)要求很高。所以，從監(jiān)管、生產(chǎn)相關(guān)以及經(jīng)濟(jì)角度來看，通過穩(wěn)定的包裝細(xì)胞系生成病毒載體是首選^[4]。
四、逆轉(zhuǎn)錄病毒可以通過假分型增強(qiáng)對(duì)NK細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率
逆轉(zhuǎn)錄病毒假分型是指在病毒載體上摻入來自其他包膜病毒的糖蛋白，允許逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)更廣泛的細(xì)胞和組織。增強(qiáng) NK 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種方法是選擇最佳假型包膜蛋白。目前。已有研究結(jié)果提出了使用RD114-TR假型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與Vectofusin-1結(jié)合使用作為對(duì)PBMC來源的NK細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以高產(chǎn)量獲得高細(xì)胞毒性CD19-CAR-NK細(xì)胞的成功策略，并且α逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞比慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞具有更高的細(xì)胞毒性^[6]。有研究認(rèn)為在α和γ逆轉(zhuǎn)錄病毒環(huán)境中，RD114 / TR假型病毒顆粒的基因轉(zhuǎn)移水平高于VSVg假型病毒顆粒。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)效果可能部分是由于中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（ASCT-2，SLC1A5）的表達(dá)，RD114/TR利用該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞。使用RD114 / TR假型α逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與Retronectin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合，可在NKL細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)水平超過90%，在原代NK細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)水平高達(dá)60%^[2]。

參考文獻(xiàn)

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[2]Suerth, J.D., Morgan, M.A., Kloess, S. et al. Efficient generation of gene-modified human natural killer cells via alpharetroviral vectors. J Mol Med 94, 83–93 (2016).

[3]Matosevic, Sandro. “Viral and Nonviral Engineering of Natural Killer Cells as Emerging Adoptive Cancer Immunotherapies.” Journal of immunology research vol. 2018 4054815. 17 Sep. 2018, doi:10.1155/2018/4054815

[4]Matosevic, Sandro. “Viral and Nonviral Engineering of Natural Killer Cells as Emerging Adoptive Cancer Immunotherapies.” Journal of immunology research vol. 2018 4054815. 17 Sep. 2018, doi:10.1155/2018/4054815

[5]Franks SE, Wolfson B, Hodge JW. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131. doi: 10.3390/cancers12082131.

[6]Müller, Stephan et al. “High Cytotoxic Efficiency of Lentivirally and Alpharetrovirally Engineered CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor Natural Killer Cells Against Acute Lymphoblastic Leukemia.” Frontiers in immunology vol. 10 3123. 24 Jan. 2020, doi:10.3389/fimmu.2019.03123

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