CRISPR/CAS9技術(shù)在細(xì)胞治療領(lǐng)域應(yīng)用
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）最初發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末，是一種由交替重復(fù)和非重復(fù)DNA序列組成的不尋常的遺傳結(jié)構(gòu)。CRISPR/Cas系統(tǒng)本質(zhì)上是一種針對外源DNA的細(xì)菌防御機(jī)制。基因組分析表明，CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，并通過RNA引導(dǎo)的DNA切割系統(tǒng)保護(hù)原核DNA免受噬菌體和質(zhì)粒DNA的攻擊[1, 2]。
CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前研究最深入、技術(shù)最成熟、應(yīng)用最廣泛的一種類別。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一個(gè)單鏈向?qū)NA（single-guide RNA, sgRNA）和一個(gè)具有核酸內(nèi)切酶功能的Cas9 蛋白組成。在sgRNA特異性識別下，Cas9蛋白到達(dá)基因組特定位點(diǎn)，對雙鏈DNA（double-stranded, dsDNA）進(jìn)行切割，產(chǎn)生dsDNA斷裂（double-strand break, DSB）。然后，DSB通過細(xì)胞自主性的非同源末端連接（nonhomologous DNA end joining, NHEJ）或同源重組（homology-directed repair, HDR）進(jìn)行修復(fù)，其中占主導(dǎo)地位的NHEJ修復(fù)容易引發(fā)突變[3]。
二、CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送技術(shù)
天然的Cas蛋白在編輯效率和特異性等方面仍存在許多局限性，可能會(huì)在錯(cuò)位的基因位點(diǎn)切割DNA雙鏈，從而導(dǎo)致潛在風(fēng)險(xiǎn)，顯著影響了它的實(shí)際應(yīng)用。研究者們通過開發(fā)不同的Cas9變體，來降低錯(cuò)配率，增加編輯效率[4-6]。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送方式也是影響基因編輯效率關(guān)鍵因素之一[7]。遞送主要通過三種形式：①遞送編碼Cas9和sgRNA的質(zhì)粒DNA；②遞送Cas9 mRNA和sgRNA元件；③遞送RNP(ribonucleoprotein,Cas9蛋白和sgRNA復(fù)合物）。根據(jù)不同的遞送形式選擇不同的遞送方式，可以根據(jù)細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制分成主要的三組：（1）生物方法，（2）化學(xué)方法，（3）物理方法。生物方法利用天然生物材料，例如病毒蛋白，多肽或者細(xì)胞受體/膜來介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。這一類別包括病毒載體，病毒樣粒子（VLPs），以及細(xì)胞穿透肽（CPPs）。化學(xué)方法使用人工合成的材料，例如聚合物，脂質(zhì)，或者金屬，來促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞。這類包括脂質(zhì)體，金納米粒子（AuNPs），以及脂質(zhì)納米粒子（LNPs）。物理方法依賴于電力或者超聲的物理能將基因遞送進(jìn)細(xì)胞。這一類別包括電穿孔，聲孔效應(yīng)，以及顯微注射。
圖2 CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)（圖片來自J Control Release, 2022, 342: 345-61）
三、CRISPR/Cas9技術(shù)在基因與細(xì)胞治療研究進(jìn)展
CRISPR/Cas9技術(shù)相比一代和二代基因編輯技術(shù)，因其操作便捷、簡單、高效等特點(diǎn)，在基因敲除、基因沉默、基因敲入、基因激活及表觀遺傳修飾等方面表現(xiàn)出色，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥醫(yī)學(xué)研究。Transparency Market Research (TMR)發(fā)布的一份題為《CRISPR和Cas基因市場-全球行業(yè)分析、規(guī)模、份額、增長、趨勢和預(yù)測，2018-2026》的報(bào)告稱，到2026年，全球CRISPR和Cas基因市場價(jià)值達(dá)到72.345億美元，2018年至2026年的復(fù)合年增長率約為20.1%?；蚓庉嫾夹g(shù)用于預(yù)防多種疾病，以及慢性病替代醫(yī)學(xué)的需求增加以及亞太地區(qū)主要參與者的投資增加，預(yù)計(jì)將是2018年至2026年推動(dòng)市場發(fā)展的主要因素。
（1）CRISPR/Cas9 全基因組功能篩選
通過構(gòu)建CRISPR-Cas9文庫，可大規(guī)模篩選、分析、驗(yàn)證一些藥物靶點(diǎn)、抗藥基因，為疾病治療提供相關(guān)數(shù)據(jù)。研究人員利用CRISPR-Cas9文庫全基因組篩選人類胃癌AGS細(xì)胞潛在治療靶點(diǎn)，最終41個(gè)必需基因被確定為潛在的藥物靶標(biāo)[8]。此外，利用CRISPR-Cas9文庫對癌癥細(xì)胞中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子p53和ERα的增強(qiáng)子元件的685個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行篩查，共鑒定出3個(gè)增強(qiáng)元件與ERα的相關(guān)；3個(gè)增強(qiáng)元件與p53功能相關(guān)聯(lián)，其中2個(gè)增強(qiáng)元件與p53完全結(jié)合才能激活細(xì)胞衰老過程[9]。
（2）模型構(gòu)建
疾病模型主要用于模擬人類疾病的生物學(xué)和病理特征的研究，在疾病發(fā)生機(jī)制和藥物篩選等方面中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
大多數(shù)動(dòng)物模型都是通過敲除特定基因構(gòu)建的[10]。研究人員利用CRISPR技術(shù)靶向猴子SHANK21基因的外顯子3，成功構(gòu)建了由于SHANK3基因突變而導(dǎo)致猴子及其F1后代的ASD模型，顯示出非典型的自閉癥表型，如重復(fù)行為增加以及社交和學(xué)習(xí)缺陷等[11]。基于單堿基編輯的點(diǎn)突變敲入在構(gòu)建動(dòng)物模型具有較大潛力。研究人員通過對RAG1、RAG2和IL2RG位點(diǎn)終止密碼子進(jìn)行單堿基編輯，提前結(jié)束基因的表達(dá)。將這些胚胎種植給代孕豬后，發(fā)現(xiàn)攜帶純合或雜合突變的仔豬都會(huì)因胸腺和脾嚴(yán)重發(fā)育不足，造成免疫缺陷導(dǎo)致肺部感染等。這也是第一次將單堿基編輯技術(shù)用于大型動(dòng)物[12]。除此之外，構(gòu)建體外細(xì)胞模型也有助于篩選藥物作用靶點(diǎn)，為揭示藥物作用機(jī)制以及疾病機(jī)制提供依據(jù)。
（3）細(xì)胞治療
免疫治療是通過調(diào)動(dòng)患者自身免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的一種方法，主要分為免疫檢查點(diǎn)阻斷和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（CAR-T）。CRISPR/Cas9技術(shù)不同于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的隨機(jī)整合，可以精準(zhǔn)靶向目的基因，進(jìn)行基因改造。由于異體CAR-T細(xì)胞存在內(nèi)源性HLA和TCR，阻礙治療的廣泛應(yīng)用，人們提出了多種治療策略去制備CAR-T。考慮到粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）在誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴中的重要作用。2019年，Sterner等[13]使用CRISPR/Cas9對CD19 CAR-T細(xì)胞的GM-CSF基因進(jìn)行敲除。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，GM-CSF基因敲除的CAR-T細(xì)胞的GM-CSF的分泌的確明顯減弱，但是對CAR-T細(xì)胞的重要功能并未造成影響，更重要的是GM-CSF缺陷的CD19 CAR-T細(xì)胞比野生型的CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)具有明顯的抗腫瘤效果。2020年Carl June等[14]去除內(nèi)源性T細(xì)胞受體（TCR）和免疫檢查點(diǎn)分子程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）改善工程T細(xì)胞的功能和持久性，引入了合成的癌癥特異性TCR轉(zhuǎn)基因（NY-ESO-1）來識別腫瘤細(xì)胞（第一個(gè)多重CRISPR/Cas9編輯工程應(yīng)用于臨床試驗(yàn)）。同年我國盧鈾教授CRISPR-Cas9編輯PD-1 T細(xì)胞在晚期非小細(xì)胞肺癌患者中的首次人體I期臨床試驗(yàn)的結(jié)果（ClinicalTrials.gov NCT02793856），其余臨床試驗(yàn)如下表所示[15]。
表1 正在進(jìn)行的使用CRISPR技術(shù)設(shè)計(jì)的免疫療法治療人類癌癥臨床試驗(yàn)
（4）基因治療
基因治療（gene therapy）是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異?；蛞鸬募膊?，以達(dá)到治療目的。CRISPR/Cas9技術(shù)憑借其編輯效率高、可同時(shí)靶向多個(gè)靶基因等特點(diǎn)，已被用于腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、造血系統(tǒng)疾病和艾滋病等疾病的基因治療。
CRISPR Therapeutics宣布了其名為CTX001的療法取得了早期成功，該療法通過電穿孔將CRISPR-Cas9遞送至造血干細(xì)胞。用白消安對患者自身的造血干細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)清除后，將被CRISPR-Cas9編輯后的造血干細(xì)胞輸注回患者體內(nèi)。接受治療的β-地中海貧血或鐮狀細(xì)胞病患者長時(shí)間不再依靠輸血治療[16]。
NTLA-2001正在開發(fā)作為轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(ATTR)淀粉樣變性病的單劑量治療制劑。NTLA-2001是一種體內(nèi)基因編輯治療劑旨在通過降低血清中TTR的濃度來治療ATTR淀粉樣變。該療法基于CRISPR/Cas，它是第一個(gè)，以脂質(zhì)納米顆粒的形式被輸送到血液中全身給藥的CRISPR療法[17]。
Editas Medicine公司研發(fā)的一款仍處于臨床試驗(yàn)期的產(chǎn)品EDIT-101。該藥物使用AAV介導(dǎo)遞送CRISPR/Cas9，通過sgRNA靶向以去除由CEP26基因中的IVS290突變產(chǎn)生的異常剪接供體，并恢復(fù)正常的CEP290表達(dá)治療先天性黑蒙。該療法可以做到一次性給藥即治愈（NCT03872479）。
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