嵌合病毒載體
腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)無論在體內(nèi)和體外試驗中均被廣泛應用于基因轉(zhuǎn)導實驗。AAV可以感染大量種類的哺乳動物細胞,在人體內(nèi)只產(chǎn)生極低的免疫原性,這些特點使重組AAV成為當今應用于基因治療的高效病毒載體。在基因治療的臨床前和臨床階段的研究中,可通過Baculovirus-AAV嵌合病毒載體高效且大規(guī)模生產(chǎn)重組AAV以符合劑量和安全性要求。
利用桿狀病毒(Baculovirus)生產(chǎn)重組AAV需要將兩種桿狀病毒共轉(zhuǎn)導昆蟲Sf9細胞。第一種桿狀病毒表達位于兩個AAV ITR元件之間的目的基因,第二個桿狀病毒表達AAV rep和cap基因。為制備兩種桿狀病毒,每種桿狀病毒的表達框均被克隆至一個桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。該質(zhì)粒的整個表達框與慶大霉素(Gentamycin)抗性基因位于質(zhì)粒上的兩個Tn7轉(zhuǎn)座子末端序列之間(Tn7L和Tn7R)。該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至帶有桿粒(Bacmid)和輔助載體的大腸桿菌。桿??梢员豢醋饕粋€特別巨大的質(zhì)粒,包含了修飾過后的桿狀病毒基因組序列。該序列上帶有l(wèi)acZ基因以及位于該基因內(nèi)部的attTn7位點。因此轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上兩個Tn7之間的序列通過Tn7轉(zhuǎn)座酶與桿粒重組后將插入lacZ基因,隨后通過慶大霉素抗性篩選和藍白篩選即可獲得重組成功的大腸桿菌。從大腸桿菌提取的桿粒純化后用于轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞。
使用AAV轉(zhuǎn)導宿主細胞時,兩個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一同進入細胞,線性雙鏈DNA基因組以游離體DNA的形式存在于細胞核中。在分裂細胞中,由于游離體DNA不跟隨細胞復制,AAV基因組將隨著細胞分裂逐漸丟失,因此在整體細胞中被稀釋。重組AAV的DNA隨機整合宿主基因組的現(xiàn)象是非常罕見的,這對于需要考慮外源DNA插入宿主基因組引發(fā)致癌風險的基因治療來說是相當適用的特點。
AAV的另一個應用優(yōu)點在于,在大多數(shù)情況下,可以在生物安全1級(BSL1)設施中完成操作。重組AAV是復制缺陷型的,不會引起炎癥反應和引發(fā)人類疾病。
人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株,根據(jù)病毒表面衣殼蛋白的不同抗原將它們分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織嗜性(即感染組織特異性)。