此后，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腫瘤中免疫細(xì)胞的增殖和凋亡等能力在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)沒(méi)有展示出不同，但注射阻斷劑（LFA-1）能有效抑制ZT13組的腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，這表明時(shí)間節(jié)律很可能是影響了免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)功能。

隨后，作者通過(guò)注射免疫細(xì)胞至處于不同時(shí)間節(jié)律的荷瘤小鼠模型，進(jìn)一步確認(rèn)其浸潤(rùn)是受到時(shí)間節(jié)律的影響。作者分別給處于ZT1和ZT13的荷瘤小鼠注射了OVA-specific CD8+T細(xì)胞（OT-l cell），2小時(shí)后觀察發(fā)現(xiàn)ZT13注射的小鼠腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量更多，且后續(xù)數(shù)日的腫瘤控制效果更佳。鑒于LFA-1是一種整合素抗體，作者還在不同時(shí)間段觀察了LFA-1的抗原在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)量。結(jié)果表明，細(xì)胞間粘附因子1（ICAM-1）是其中唯一表現(xiàn)出晝夜節(jié)律的分子。此后，作者在“時(shí)間節(jié)律基因”敲除小鼠（Cdh^5creERT2:Bmal1^flox, Bmal1^DEC）體內(nèi)觀察到ICAM-1不再隨時(shí)間變化而變化，并且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)也不再出現(xiàn)時(shí)間節(jié)律。

在免疫表型方面，作者比較了不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)收獲的腫瘤中，高表達(dá)抗腫瘤基因的淋巴細(xì)胞與高表達(dá)促腫瘤基因的淋巴細(xì)胞，非耗竭CD8+細(xì)胞與耗竭CD8+細(xì)胞等比值指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)這些免疫表型也受到時(shí)間節(jié)律的影響。在發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞激活等基因表達(dá)也與時(shí)間節(jié)律相關(guān)后，作者聚焦于PD-1受體的表達(dá)量，通過(guò)RNA層面和表面蛋白兩個(gè)層面確認(rèn)了PD-1受體在腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)受時(shí)間節(jié)律調(diào)節(jié)的現(xiàn)象。為了確認(rèn)腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)與時(shí)間節(jié)律相關(guān)，研究團(tuán)隊(duì)還在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用了“時(shí)間節(jié)律基因”敲除小鼠（Cd4^cre:Bmal1^flox, Bmal1^DT）進(jìn)行研究，結(jié)果表明PD1受體在腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)變化在“時(shí)間節(jié)律基因”敲除小鼠體內(nèi)消失。

為了探究時(shí)間節(jié)律是否影響PD-1抗體治療的效果，作者構(gòu)建了黑色素瘤小鼠，并發(fā)現(xiàn)ZT1時(shí)間段注射PD-1抗體的效果不如ZT13時(shí)間段給藥，且這一注射時(shí)間的不同，持續(xù)影響其后十?dāng)?shù)日的抗腫瘤效果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，注射PD-1抗體后，在ZT13時(shí)間段分離出來(lái)的腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞在分泌能力和因子表達(dá)上稍強(qiáng)。最后，作者收集了不同時(shí)間段切除的黑色素瘤樣本，通過(guò)分析樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)時(shí)間節(jié)律對(duì)淋巴細(xì)胞的影響同樣在人身上存在。其中，作者著重提及了盡管CD8+T細(xì)胞在人黑色素瘤的浸潤(rùn)頂峰是下午早段，但這一時(shí)間的腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的耗竭程度也會(huì)更高。

概括而言，本文介紹了時(shí)間節(jié)律對(duì)免疫細(xì)胞尤其是CD8+T細(xì)胞，在腫瘤治療方面的影響。研究團(tuán)隊(duì)在小鼠身上發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在晚上（ZT13）的腫瘤浸潤(rùn)程度更高，且在晚上對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行免疫細(xì)胞療法或抗體療法都能獲得更好的治療效果。相應(yīng)地，時(shí)間節(jié)律對(duì)人的黑色素瘤瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量及生物特征也有影響，該研究或許可以幫助免疫細(xì)胞療法更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。

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