喜訊|首席科學(xué)家王建勛教授團(tuán)隊發(fā)表新冠駝源納米抗體研究SCI論文
新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要途徑之一是通過其膜表面的眾多刺突蛋白（Spike protein，S-protein，簡稱S蛋白）識別并結(jié)合細(xì)胞膜表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2受體（angiotensin converting enzyme 2，ACE2），以此介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合。S蛋白中S1亞基的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Receptor-binding domain，RBD）是研究SARS-CoV-2與ACE2受體結(jié)合以及抗體識別的關(guān)鍵區(qū)域，被認(rèn)為是迄今為止最有效的抗SARS-CoV-2中和抗體(neutralizing antibodies ,NAbs)的靶標(biāo)。中和抗體療法是人類應(yīng)對病毒感染疾病的有利武器之一，因其能達(dá)到治療加預(yù)防的雙重效果而備受關(guān)注和期待。中和抗體發(fā)揮作用往往是通過與病毒RBD結(jié)合，進(jìn)而阻止病毒吸附于ACE2受體。
學(xué)術(shù)發(fā)表
該研究的主要結(jié)果以題為“A Competitive Panning Method Reveals an Anti-SARS-CoV-2 Nanobody Specific for an RBD-ACE2 Binding Site”的論文于2023年2月在線發(fā)表。論文通訊作者為我司首席科學(xué)家王建勛教授，第一作者是王建勛教授的碩士研究生和似琦。
北京中醫(yī)藥大學(xué)特聘教授 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
深圳細(xì)胞谷生物醫(yī)藥有限公司 碩士研究生和似琦
首席科學(xué)家王建勛教授
王建勛教授團(tuán)隊自2020年開始進(jìn)行基于噬菌體展示技術(shù)的納米抗體篩選平臺的建設(shè)，目前已完成對抗SARS-CoV-2免疫文庫的構(gòu)建及抗體篩選，團(tuán)隊進(jìn)一步的研究目標(biāo)還包括篩選新型的單鏈可變抗體（single-chain variable fragment，ScFv）及納米抗體作為CAR的靶向結(jié)構(gòu)域。
基于噬菌體展示的方法、納米抗體的優(yōu)良生物特性及RBD與ACE2結(jié)合介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的基本原理，本研究利用實驗室前期構(gòu)建的抗SARS-CoV-2噬菌體納米抗體免疫文庫，以野生型SARS-CoV-2 RBD（記為SARS-CoV-2 RBD WT）為靶標(biāo)抗原，采用RBD-ACE2競爭淘選方法對文庫進(jìn)行淘篩，成功得到了一種能夠在體外高效阻斷SARS-CoV-2 RBD與ACE2重組蛋白結(jié)合的納米抗體，且該抗體顯示出了對SARS-CoV-2 WT假病毒的高效中和能力，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析表明該抗體能特異性結(jié)合RBD與ACE2的共享表位。此外，本研究還通過測定該納米抗體與展示SARS-CoV-2突變株RBD的重組噬菌體的結(jié)合，初步推斷了該納米抗體對新冠病毒幾個關(guān)鍵突變株的結(jié)合能力。
論文簡介
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新冠肺炎在全球的傳播突顯了快速開發(fā)針對SARS-CoV-2的治療和預(yù)防藥物的高效方法的必要性。在眾多療法中，相較于傳統(tǒng)疫苗研發(fā)、小分子藥物開發(fā)耗時長，血漿療法來源有限成效不定且難以推廣，中和抗體的優(yōu)勢逐漸突顯。中和抗體是經(jīng)過人為篩選、制備驗證后得來的針對新冠病毒具有預(yù)防治療雙重作用的抗體，成分單一、安全性好，可精準(zhǔn)靶向新冠病毒的抗原位點。在對主要感染部位是呼吸道和肺部的病毒性肺炎的治療策略中，納米抗體（nanobody，Nb又稱為重鏈可變區(qū)單域抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH）的使用具有其獨特優(yōu)勢。得益于納米抗體分子量小、常溫下能保持穩(wěn)定等優(yōu)良的理化性質(zhì)，有效霧化并局部給藥以提高呼吸道、肺泡等病毒感染病灶部位的藥物濃度成為可能。
噬菌體庫普通淘選的一般流程是表面展示納米抗體的噬菌體與固定化目標(biāo)抗原SARS-CoV-2 RBD識別并結(jié)合，經(jīng)過足夠時間的孵育之后，通過嚴(yán)格的洗滌條件洗去與抗原結(jié)合較弱或者未結(jié)合的游離噬菌體，隨后將特異性結(jié)合的目標(biāo)噬菌體洗脫下來，感染大腸桿菌并進(jìn)行擴(kuò)增以得到下一輪的子噬菌體庫。經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集過程后，能夠與抗原特異性結(jié)合的噬菌體的比例得到了逐步提高，最終獲得能夠識別靶分子的納米抗體用于后續(xù)的實驗。本研究設(shè)計的簡便快捷的噬菌體免疫文庫競爭篩選模式（圖1），在第二、三輪淘選的階段動態(tài)地引入了非固定化的ACE2蛋白與展示VHH噬菌體競爭與固定化靶抗原SARS-CoV-2 RBD的結(jié)合，從而在淘選流程中集合了親和力篩選和競爭淘選的雙重目標(biāo)（表1）。
圖1. 噬菌體納米抗體庫RBD-ACE2競爭淘選流程示意圖
表1.淘選流程條件及每輪的富集度計算結(jié)果
共計完成三輪淘篩，顯示展示抗SARS-CoV-2納米抗體噬菌體庫成功淘篩富集。從第三輪篩選后的平板上隨機(jī)挑取24個單菌落，接種培養(yǎng)制備噬菌體上清，通過phage ELISA實驗鑒定成功與包被RBD結(jié)合的陽性克隆，在其中選取A450值較高的10個陽性克隆送測。對測序結(jié)果進(jìn)行MEGA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，并采用競爭phage ELISA實驗驗證展示VHH的噬菌體體外阻斷RBD-ACE2結(jié)合的能力，最終選定阻斷能力最強的VHH A5克隆，用于進(jìn)一步的原核表達(dá)和鑒定，稱作納米抗體VHH5-05。
通過同源重組構(gòu)建“pET-VHH5-05-His”質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）表達(dá)菌株。在30℃，220rpm培養(yǎng)條件下用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的生產(chǎn)，生產(chǎn)6h后，將細(xì)胞破碎上清中的可溶性蛋白進(jìn)行Ni柱親和純化，并對純化過程的流穿液、清洗液、洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示洗脫得到的目的蛋白純度高，分子量大小在13KD左右，與理論分子量符合。
B.蛋白純化SDS-PAGE分析。M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1：破碎后上清；2：流穿；3-14：梯度咪唑洗脫。
為了評價純化后的VHH5-05抗體的生物活性，團(tuán)隊通過ELISA驗證了該抗體的結(jié)合特異性及測定抗體親和力，結(jié)果表明VHH5-05能夠以高親和力（EC50=0.03 nM）特異地結(jié)合SARS-CoV-2(WT)RBD。同樣以競爭ELISA實驗驗證純化抗體在體外阻斷RBD與ACE2重組蛋白結(jié)合的能力，在濃度為0.5µg/mL時，VHH5-05顯示出明顯的RBD-ACE2結(jié)合阻斷作用，且在濃度降低至0.1µg/mL的情況下其阻斷效果仍然顯著，進(jìn)一步證實了本研究設(shè)計采用的競爭淘選方法的可行性。基于該驗證步驟的結(jié)果，可以初步推斷篩選出的VHH5-05抗體與RBD-ACE2的結(jié)合位點有相當(dāng)重合。進(jìn)行假病毒中和試驗以測定VHH5-05的中和活性，結(jié)果表明，VHH5-05能高效中和SARS-CoV-2WT假病毒，其IC50為0.026μg/mL。
制備含有SARS-CoV-2各突變株RBD片段的重組改造M13KO7噬菌體，使用高吸附酶標(biāo)板包被純化得到的納米抗體，分別加入各突變株RBD重組噬菌體以結(jié)合抗體，采用qPCR法擴(kuò)增結(jié)合在板上的噬菌體的基因片段以間接地反映納米抗體與重組噬菌體的特異性結(jié)合情況，用于初步驗證納米抗體與SARS-CoV-2不同突變株 RBD的結(jié)合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究篩選純化得到的納米抗體VHH5-05，不僅只對展示野生型RBD的噬菌體表現(xiàn)出了強的結(jié)合能力，對展示Beta突變株RBD和Delta突變株RBD的噬菌體也表現(xiàn)出明顯的結(jié)合。然而，本次篩選出的納米抗體未能對展示Omicron突變株 RBD的噬菌體表現(xiàn)出結(jié)合能力，這與眾多研究得出的Omicron突變株逃逸了絕大部分現(xiàn)有中和抗體的結(jié)論一致。
C. RBD-ACE2-VHH5-05競爭ELISA結(jié)果顯示VHH5-05能在體外高效阻斷RBD-ACE2重組蛋白的結(jié)合；
為了探索VHH5-05阻斷SARS-CoV-2 RBD和ACE2之間相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，模擬了VHH5-05和RBD復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并與RBD-hACE2復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)合表位的比較。VHH5-05的同源模型通過SWISS-model在線服務(wù)器建立，以MOE軟件進(jìn)行分子對接以模擬蛋白質(zhì)相互作用，Dock包中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接模塊用于實現(xiàn)RBD和VHH5-05之間的對接計算。SARS-CoV-2的受體結(jié)合基序（receptor?binding motif ，RBM）為437-508 aa。hACE2中與RBM相互作用的關(guān)鍵氨基酸為K31、E35、D38、M82和K353。與SARS-CoV-2相對應(yīng)的氨基酸為L455、F486、Q493、S494、N501和Y505。建模分析結(jié)果表明，RBD-VHH5-05表位上的大多數(shù)殘基與RBD-ACE2結(jié)合界面重疊，特別是SARS-CoV-2 RBD的關(guān)鍵位點F486、Q493和S494參與了其與VHH5-05的結(jié)合，這也再次支持了該納米抗體能夠有效阻斷RBD-ACE2結(jié)合的研究結(jié)論。
常規(guī)的噬菌體篩選是先拿到結(jié)合目標(biāo)靶抗原的抗體，表達(dá)純化后驗證是否具有生物學(xué)功能，再驗證是否能阻斷受體與配體的結(jié)合，通常在高通量篩選中的幾百甚至幾千個抗體中才有機(jī)會得到三兩個到十幾個具有阻斷活性的抗體，效率低且成功率不高。本研究以一種組合篩選策略:嚴(yán)格的淘選和引入非固定化ACE2進(jìn)行競爭，指導(dǎo)淘選過程，整個流程以低成本且方便快捷的方式，增加了篩選出高親和力且能直接阻斷RBD與ACE2結(jié)合的抗體展示噬菌體的可能性，將是體外淘篩能直接阻斷SARS-CoV-2 RBD-ACE2結(jié)合的納米抗體的最佳選擇之一。
盡管最有效的中和抗體往往直接干擾RBD和ACE2的結(jié)合，這也是本研究開發(fā)競爭淘選方法的初衷，然而在Omicron變異株中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)RBD突變（15個中的9個）位于ACE2與RBD的結(jié)合基序RBM中， 高度可變的Q493/N/E/R/Y可能是導(dǎo)致納米抗體VHH5-05被Omicron逃逸的直接原因?？上驳氖?，已有相關(guān)研究表明開發(fā)針對S蛋白或RBD隱藏位點、保守中和位點、非ACE2競爭位點等篩選得到的中和抗體仍具備一定的抵抗Omicron突變株感染的能力。我們期待，多方法多平臺的應(yīng)用和抗體藥物等的發(fā)現(xiàn)能為人類構(gòu)建機(jī)體“免疫長城”添磚加瓦，為細(xì)胞免疫治療各類疾病貢獻(xiàn)力量。
