一、簡介
目前使用最多的CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建方法主要包括３類：以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為代表的病毒載體、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和mRNA介導(dǎo)的非病毒載體以及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)^[1]。不論是病毒載體還是非病毒載體，都有其各自的優(yōu)勢和劣勢以及適合的疾病類型。我們在CAR-T細(xì)胞的制備過程中需要根據(jù)自己的需求選擇最優(yōu)的載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

二、病毒載體
γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體是目前常用的兩個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。FDA批準(zhǔn)上市的第一款CAR-T治療產(chǎn)品Kymriah使用的是慢病毒載體，而上市的第二款Yescarta（中國上市名：奕凱達(dá)）同時也是目前全世界銷量最高的CAR-T治療產(chǎn)品使用的為逆轉(zhuǎn)錄病毒。γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒同屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科。γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的主要區(qū)別在于逆轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期的細(xì)胞，而慢病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期的細(xì)胞（不包括處于G0期的細(xì)胞），但獲得慢病毒載體的方法復(fù)雜且昂貴，因為慢病毒采用瞬時包裝系統(tǒng)，也存在多質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染帶來的批間差等問題^[2]。與之相反，逆轉(zhuǎn)錄病毒可以通過穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞系產(chǎn)毒，這極大的降低了產(chǎn)品生產(chǎn)的時間與成本。不論是逆轉(zhuǎn)錄病毒還是慢病毒都有可能出現(xiàn)復(fù)制型病毒的潛在安全風(fēng)險，因此需要對生產(chǎn)全過程進(jìn)行嚴(yán)格的把控^[3]。綜上所述，轉(zhuǎn)錄病毒載體具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)率和長期穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，然而其可攜帶的轉(zhuǎn)基因數(shù)量有限，且臨床安全檢測成本高。

三、非病毒載體
轉(zhuǎn)座子由轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段及兩側(cè)包含轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點的反向末端重復(fù)序列（TIRs）兩部分組成。在轉(zhuǎn)座過程中，轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)從供體載體上切除元件。隨后將轉(zhuǎn)座子整合到染色體位點。這一特征使轉(zhuǎn)座子成為非病毒基因傳遞系統(tǒng)，它結(jié)合了病毒載體（穩(wěn)定的染色體整合和持久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)）與非病毒傳遞系統(tǒng)（較低的免疫原性、增強的安全性和降低的GMP制造成本）的優(yōu)點^[4]。但是，由于轉(zhuǎn)座子可隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因，帶來了臨床安全和效率問題，天然轉(zhuǎn)座子允許轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因重復(fù)改變基因位置，增加了質(zhì)量控制難度。除此之外，多種基于RNA的載體已被優(yōu)化用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)染。Joel G. Rurik等人^[5]利用LNP-mRNA的方法制備瞬時抗纖維化CAR-T細(xì)胞。由于mRNA被限制在細(xì)胞質(zhì)中，不能整合基因組，本質(zhì)上不穩(wěn)定，并且在細(xì)胞分裂過程中被稀釋，因此用修飾的mRNA靶向脂質(zhì)納米顆粒治療可減少損傷后的纖維化并恢復(fù)心功能。

四、小結(jié)
除了以上介紹的病毒與非病毒載體外，第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9具有操作簡便、高效低廉，以及多重基因組編輯等特點。但在使用過程中存在一定的脫靶率和潛在的致癌風(fēng)險。綜上所述，CAR-T作為細(xì)胞治療的新興領(lǐng)域，其結(jié)構(gòu)與制備方法還在不斷的優(yōu)化與完善中，用相對較低的成本使其快速、精準(zhǔn)的靶向腫瘤細(xì)胞，并且具有良好的安全性，是每一個在細(xì)胞治療領(lǐng)域人的共同心愿。

參考文獻(xiàn)
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[4] Irving M, Lanitis E, Migliorini D, Ivics Z, Guedan S. Choosing the Right Tool for Genetic Engineering: Clinical Lessons from Chimeric Antigen Receptor-T Cells. Hum Gene Ther. 2021 Oct;32(19-20):1044-1058. doi: 10.1089/hum.2021.173. PMID: 34662233; PMCID: PMC8697565.
[5] Rurik JG, Tombácz I, Yadegari A, Méndez Fernández PO, Shewale SV, Li L, Kimura T, Soliman OY, Papp TE, Tam YK, Mui BL, Albelda SM, Puré E, June CH, Aghajanian H, Weissman D, Parhiz H, Epstein JA. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science. 2022 Jan 7;375(6576):91-96. doi: 10.1126/science.abm0594. Epub 2022 Jan 6. PMID: 34990237; PMCID: PMC9983611.

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